Forschungsprojekte

(Anja Büscher, Marvin Droste, Stefanie Jeruschke)

Im Rahmen dieses Forschungsprojektes soll die Gewinnung von extrazellulären Vesikeln (Exosomen) aus Urin etabliert werden. Ziel ist es, die in den urinären Exosomen von Patienten mit nephrotischem Syndrom enthaltenen erkrankungsspezifischen Erbinformationen und Proteine hinsichtlich ihrer Relevanz als diagnostische und prognostische Biomarker für den klinischen Verlauf des nephrotischen Syndroms des Kindesalters zu untersuchen. Dabei werden 4 Gruppen von Patienten in Abhängigkeit von deren Krankheitsverlauf unterschieden: Patienten mit seltenen bzw. häufigen Rezidiven, Patienten mit Steroidabhängigkeit und mit Steroidresistenz. Die Proben werden zum Zeitpunkt eines Rezidivs wie auch im nicht-proteinurischen Intervall gewonnen. Die Ergebnisse werden im Anschluss mit dem Krankheitsverlauf der Patienten korreliert. Eventuelle Unterschiede im Exosomenmuster der untersuchten Patientengruppen sollen zur Identifizierung und Evaluation von Markerproteinen genutzt werden, deren unterschiedliche Expression frühzeitig Hinweise auf den potentiellen Krankheitsverlauf eines Patienten geben und so für Therapieentscheidungen genutzt werden könnte. Zur Vervollständigung dieser Ergebnisse sollen sowohl die patientenspezifischen Exosomen mithilfe unseres etablierten Podozytenmodells als auch die Exosomen der Podozyten-Zellkultur in einem gängigen Modell der podozytären Schädigung unter Medikation (Steroide, Immunsuppresiva) genauer untersucht werden.

Kooperationspartner: PD Dr. rer. nat. Bernd Giebel (Transfusionsmedizin Universitätsklinikum Essen) und Dr. Basant Kumar Thakur (Klinik für Kinderheilkunde III, Universitätsklinikum Essen)

(Anja Büscher, Lina Flagel, Marvin Droste, Stefanie Jeruschke)

Die Nierentransplantation ist als einzige Form der Nierenersatztherapie mit einer annähernd normalen Lebensdauer und -qualität assoziiert. Der Mangel an Spenderorganen trifft pädiatrische Patienten besonders, da die chronische Niereninsuffizienz wichtige Entwicklungsschritte beeinträchtigt und sie aufgrund ihrer Lebenserwartung potentiell auf Folgetransplantationen angewiesen sind. Insofern ist der langfristige Erhalt der Transplantatfunktion bzw. die frühzeitige Identifizierung von relevanten Pathologien des transplantierten Organs (insbesondere zelluläre bzw. humorale Rejektion, BKV-Nephropathie) von großer Bedeutung. Bislang basiert die Diagnostik vornehmlich auf invasiven Methoden, wie z.B. der Nierenbiopsie, die aber mit dem Risiko einer Blutung behaftet ist und erfolgt in der Regel erst dann, wenn z.B. durch Bluttests bereits ein Schaden der Transplantatniere nachgewiesen wurde. Die Etablierung nicht-invasiver, spezifischer Biomarker zielt darauf ab, die aufgeführten Pathologien bereits frühzeitig, bestenfalls präemptiv, zu diagnostizieren und die immunsuppressive Therapie entsprechend anzupassen und so invasive Untersuchungsverfahren, wie die Nierenbiopsie, zu vermeiden. Urin ist ein Untersuchungsmaterial, welches nicht-invasiv und auch bei Kindern in ausreichender Menge gewonnen werden kann und das als Stoffwechselprodukt der Niere eine Momentaufnahme der Nierenfunktion abbildet. Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind biomembranumgebene Nanopartikel zellulären Ursprungs, die u.a. Proteine, RNA und Lipide aus den freisetzenden Zellen enthalten und in allen Körperflüssigkeiten, u.a. auch im Urin, nachgewiesen werden können. Aufgrund ihres zellulären Ursprungs, der durch Oberflächenmarker zurückzuverfolgen ist, werden EVs als Quelle sensitiver und spezifischer Biomarker angesehen. Urinäre EVs wurden in experimentellen Studien bereits erfolgreich für transplantationsmedizinische Fragestellungen genutzt, jedoch liegen noch zu wenige Untersuchungen an pädiatrischen Kohorten vor, um das Potential von EV-basierten Biomarkern einschätzen zu können. Zudem wurde durch die Entwicklung neuer biotechnologischer Methoden die Analyse der EVs (im Submikrongrößenbereich) erleichtert und durch die International Society of Extracellular Vesicles (ISEV) Guidelines etabliert, die die experimentelle Arbeit mit EVs weiter standardisieren und eine höhere Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Ziel des geplanten Projektes ist es, EV-basierte Biomarker (mit Fokus auf Oberflächenantigenen und EV-assoziierten RNAs) bei pädiatrischen Patienten nach Nierentransplantation zu identifizieren und ihre Wertigkeit hinsichtlich der frühzeitigen Diagnose relevanter Transplantatpathologien zu evaluieren. Dabei sollen mehrere Patientengruppen (mit zellulärer bzw. humoraler Rejektion, BKV-Nephropathie bzw. Patienten ohne Pathologie des Transplantats) miteinander verglichen werden. Die Zuordnung zu den unterschiedlichen Patientengruppen erfolgt nach Nachweis der jeweiligen Pathologie in einer Transplantatbiopsie. Darüber hinaus soll ein potentieller direkter Effekt von EVs der verschiedenen Patientengruppen auf humane Podozyten in vitro untersucht und mögliche pathophysiologisch relevante Moleküle identifiziert werden.

Kooperationspartner: PD Dr. rer. nat. Bernd Giebel (Transfusionsmedizin Universitätsklinikum Essen)

(Stefanie Jeruschke, Anja Büscher, Katharina Eulenstein)

Cytomegalievirus (CMV)-Infektionen gehören zu den häufigsten Infektionen nach Nierentransplantation. Ohne antivirale Prophylaxe entwickeln ca. 60–80% aller Transplantierter eine CMV-Infektion, die mit einem erhöhten Infektionsrisiko, einer Schädigung der Transplantatfunktion sowie akuten und chronischen Rejektionen assoziiert sein kann. Besonders häufig sind CMV-naive Patienten betroffen, die das Organ eines CMV-positiven Spenders erhalten. Patienten, die dieser Risikogruppe angehören, werden daher nach Transplantation für 3 Monate (d.h. in der Phase der stärksten Immunsuppression) prophylaktisch mit Valganciclovir behandelt. Diese antivirale Therapie kann aber mit starken Nebenwirkungen, z.B. Knochenmarksdepression, gastrointestinalen oder neurologischen Symptomen vergesellschaftet sein. Ein weiterer Risikofaktor für das Auftreten einer CMV-Infektion ist die Intensität und Art der Immunsuppression. Es konnte mehrfach gezeigt werden, dass Patienten, die immunsuppressiv mit Medikamenten aus der Gruppe der mTOR-Inhibitoren (mTORi, z.B Everolimus), auch in Kombination mit einer erniedrigten Dosis eines Calcineurin-Inhibitors (CNI), behandelt werden, ein signifikant erniedrigtes Risiko haben, eine CMV-Infektion zu entwickeln, im Gegensatz zu Patienten unter CNI-Standarddosis in Kombination mit Mycophenolat-Mofetil (MMF). Ein Wechsel zu einer mTORi-basierten Immunsuppression konnte dabei zu einer Ausheilung einer bestehenden CMV-Infektion führen und war nicht mit einer Verschlechterung der glomerulären Filtrationsrate oder höheren Rejektionsraten assoziiert. Die pathomorphologischen Veränderungen, die in der transplantierten Niere durch eine CMV-Infektion hervorgerufen werden, sind noch unzureichend untersucht und beschränken sich meist auf die Untersuchung der Tubulusepithelzellen. Die Replikation von CMV führt dabei typischerweise zu zytopathischen Veränderungen in den Tubulusepithelzellen. CMV-bedingte Veränderungen in den Glomeruli werden nur selten nachgewiesen und betreffen dann vornehmlich Endothelzellen; Veränderungen der Podozyten, die die Hauptbestandteile dieser Filtereinheiten der Niere darstellen, wurden bislang kaum beschrieben bzw. untersucht und stehen daher im Fokus unseres Projektes.

Ziel des Projekts ist die Untersuchung der Auswirkungen einer Infektion mit humanen Cytomegalie-Viren (HCMV) auf humane Podozyten in vitro. Zunächst sollen Veränderungen der Morphologie der Zellen (Zytoskelett), Zelladhäsion, Apoptose sowie assoziierte Signalwege dargestellt und analysiert werden. Im Weiteren sollen durch die Vorbehandlung mit verschiedenen immunsuppressiven Substanzen (z.B. Mycophenolat-Mofetil, Cyclosporin A, Everolimus) Erkenntnisse über Regulationsvorgänge gewonnen werden, um aufzuzeigen, warum nach Transplantation eine Behandlung mit mTOR-Inhibitoren mit einem geringeren Risiko einer CMV-Infektion assoziiert ist.

Kooperationspartner: Prof. Dr. med. Benjamin Wilde, Klinik für Nephrologie, Universitätsklinikum Essen) und Prof. Dr. rer. nat. Mirko Trilling (Institut für Virologie, Universitätsklinikum Essen)

(Anja Büscher, Stefanie Jeruschke, Lea Knipping)

Das Alport-Syndrom (AS) ist eine monogen vererbte Erkrankung und wird durch Mutationen in Kollagen Typ IV verursacht, ein Hauptbestandteil aller Gefäß-Basalmembranen. An mechanisch besonders beanspruchten Stellen (Niere, Innenohr, Augenlinse) findet man ein Netzwerk aus mehreren verschiedenen Ketten (a3/a4/a5), die über Glycin eng miteinander verbunden sind. Mutationen in Glycin führen zum Abknicken der Triple-Helix-Struktur, andere Mutationen zum vorzeitigen Kettenabbruch. Klinisch imponiert das AS mit einer Innenohrschwerhörigkeit, typischen Augenveränderungen (Lenticonus anterior) und einer progressiven Nephropathie, beginnend mit einer Mikrohämaturie und Proteinurie. Im weiteren Verlauf entwickelt sich häufig eine terminale Niereninsuffizienz mit Dialysepflichtigkeit. In der Nierenbiopsie findet man charakteristische Aufsplitterungen und Lamellierungen der glomerulären Basalmembran. Es zeigen sich dabei Genotyp- Phänotyp Assoziationen: trunkierende Mutationen führen im Mittel mit unter 20 Jahren, Glycin-Missense- Mutationen erst mit über 30 Jahren zum Nierenversagen. Die Vererbung des AS erfolgt in 85% der Fälle X-chromosomal, in 10-15% autosomal. Die Häufigkeit des X-chromosomalen AS wird auf 1:5.000 geschätzt. Hier finden sich deutliche Unterschiede der klinischen Ausprägung zwischen Männern und Frauen: männliche Patienten entwickeln oft bereits im frühen Erwachsenenalter eine terminale Niereninsuffizienz und/oder Taubheit. Mädchen/Frauen sind meist Konduktorinnen (Anlageträger), zeigen dabei aber ein breites Spektrum an Symptomen (unauffälliger Phänotyp bis hin zum Vollbild des AS) mit großer inter- und intrafamiliärer Variabilität. Insgesamt weisen aber ca. 30% der Patientinnen im Alter von 60 Jahren eine chronische Niereninsuffizienz auf. Ursächlich für diese große Variabilität könnte eine ungleiche X-Inaktivierung (Stilllegung der Transkription der Gene auf einem der beiden X-Chromosomen bei der Frau) sein. Bisher gibt es dazu nur unzureichende Daten aus Untersuchungen der X-Inaktivierung im Blut am Menschen und im Mausmodell. Die zu erwartende X-Inaktivierungs-Ratio von 1:1 kann dabei durch vielfältige Faktoren wie statistische Fluktuation, genetische Modifier oder Mutations-bedingte Selektionsvorteile oder Patientenalter verschoben sein. Es spielen zudem auch organspezifische Faktoren eine Rolle, so dass im Falle des AS insbesondere die X-Inaktivierung in den Nieren von Bedeutung ist.

Ziel des Projekts ist die Etablierung der Nierenzellisolierung aus Urin von weiblichen Alport-Patientinnen und die Bestimmung des X-Inaktivierungszustandes in diesen Zellen im Vergleich zu Blut. Bei den Patientinnen, von denen Nierenbiopsie-Material vorliegt, werden die Untersuchungen durch das nierenspezifische X-Inaktivierungsmuster ergänzt. Untersucht werden soll, ob Unterschiede im X-Inaktivierungsmuster bei Frauen die klinische Variabilität erklären können.

Kooperationspartner: PD Dr. Julia Höfele (Institut für Humangenetik, Technische Universität München (TUM), Klinikum rechts der Isar)

(Anja Büscher, Stefanie Jeruschke, Lea Knipping)

Das Alport-Syndrom (AS) ist eine monogen vererbte Erkrankung und wird durch Mutationen in Kollagen Typ IV verursacht, ein Hauptbestandteil aller Gefäß-Basalmembranen. An mechanisch besonders beanspruchten Stellen (Niere, Innenohr, Augenlinse) findet man ein Netzwerk aus mehreren verschiedenen Ketten (a3/a4/a5), die über Glycin eng miteinander verbunden sind. Mutationen in Glycin führen zum Abknicken der Triple-Helix-Struktur, andere Mutationen zum vorzeitigen Kettenabbruch. Klinisch imponiert das AS mit einer Innenohrschwerhörigkeit, typischen Augenveränderungen (Lenticonus anterior) und einer progressiven Nephropathie, beginnend mit einer Mikrohämaturie und Proteinurie. Im weiteren Verlauf entwickelt sich häufig eine terminale Niereninsuffizienz mit Dialysepflichtigkeit. In der Nierenbiopsie findet man charakteristische Aufsplitterungen und Lamellierungen der glomerulären Basalmembran. Es zeigen sich dabei Genotyp- Phänotyp Assoziationen: trunkierende Mutationen führen im Mittel mit unter 20 Jahren, Glycin-Missense- Mutationen erst mit über 30 Jahren zum Nierenversagen. Die Vererbung des AS erfolgt in 85% der Fälle X-chromosomal, in 10-15% autosomal. Die Häufigkeit des X-chromosomalen AS wird auf 1:5.000 geschätzt. Hier finden sich deutliche Unterschiede der klinischen Ausprägung zwischen Männern und Frauen: männliche Patienten entwickeln oft bereits im frühen Erwachsenenalter eine terminale Niereninsuffizienz und/oder Taubheit. Mädchen/Frauen sind meist Konduktorinnen (Anlageträger), zeigen dabei aber ein breites Spektrum an Symptomen (unauffälliger Phänotyp bis hin zum Vollbild des AS) mit großer inter- und intrafamiliärer Variabilität. Insgesamt weisen aber ca. 30% der Patientinnen im Alter von 60 Jahren eine chronische Niereninsuffizienz auf. Ursächlich für diese große Variabilität könnte eine ungleiche X-Inaktivierung (Stilllegung der Transkription der Gene auf einem der beiden X-Chromosomen bei der Frau) sein. Bisher gibt es dazu nur unzureichende Daten aus Untersuchungen der X-Inaktivierung im Blut am Menschen und im Mausmodell. Die zu erwartende X-Inaktivierungs-Ratio von 1:1 kann dabei durch vielfältige Faktoren wie statistische Fluktuation, genetische Modifier oder Mutations-bedingte Selektionsvorteile oder Patientenalter verschoben sein. Es spielen zudem auch organspezifische Faktoren eine Rolle, so dass im Falle des AS insbesondere die X-Inaktivierung in den Nieren von Bedeutung ist.

Ziel des Projekts ist die Etablierung der Nierenzellisolierung aus Urin von weiblichen Alport-Patientinnen und die Bestimmung des X-Inaktivierungszustandes in diesen Zellen im Vergleich zu Blut. Bei den Patientinnen, von denen Nierenbiopsie-Material vorliegt, werden die Untersuchungen durch das nierenspezifische X-Inaktivierungsmuster ergänzt. Untersucht werden soll, ob Unterschiede im X-Inaktivierungsmuster bei Frauen die klinische Variabilität erklären können.

Kooperationspartner: PD Dr. Julia Höfele (Institut für Humangenetik, Technische Universität München (TUM), Klinikum rechts der Isar)

Objective: Humoral and cellular immune responses to SARS-CoV-2 vaccination are reduced in adult kidney recipients. After pediatric kidney transplantation there are only few data available – mostly limited to monitoring of SARS-CoV-2 antibodies. Method: Cellular and humoral immune responses have been monitored before and after SARS-CoV-2 vaccination in pediatric kidney recipients. After in vitro stimulation with SARS-CoV-2 antigen (spike glycoprotein) virus-specific CD4 and CD8 T cells (SARS-CoV-2-Tvis) have been identified by cytokine flow cytometry. SARS-CoV-2 IgG was measured by CMIA. Results: Immune response after SARS-CoV-2 vaccination was analyzed in a total of 30 pediatric kidney recipients (age at 1st vaccine dose 5.2 – 17.8 years, median 14.8 years; 43% male; 30/30 2 vaccine doses; 23/30 3 vaccine doses). At time of vaccination 22 patients (73%) received a tacrolimus (Tac)-based immunosuppression combined with mycophenolate mofetil (MMF; n = 15) or everolimus (n = 6) or neither of them (n = 1); 3 patients were exposed to cyclosporine A and 5 patients to a calcineurin inhibitor (CNI)free immunosuppression. MMF was used in 18/30 patients. After 1st dose of mRNA vaccine SARS-CoV-2 antibodies were detectable in 50% of pediatric kidney recipients, after 2nd dose in 78% and after 3rd dose in 88%. After the 2nd vaccine dose absence of humoral immune response (< 33.8 BAU/ml) was only found in case of MMF use (predominately combined with Tac). Peak IgG values (> 2,080 BAU/ml) were only detected in MMF-free regimens (6/7). Cellmediated response partially differed from humoral response, e. g., in some patients SARS-CoV2-Tvis were found despite lack of virus-specific antibodies. After 1st vaccine dose SARS-CoV-2-Tvis were detectable in 50% of pediatric kidney recipients, after 2nd dose in 92%. After 2nd vaccine dose absence or very low levels of SARS-CoV-2-Tvis (< 0.3 cells/µl) were only found in Tac-based immunosuppressive regimens, whereas higher levels (> 1.3 cells/µl) were exclusively detected in patients with MMFfree medication. Conclusion: After pediatric kidney transplantation humoral and cellular immune responses to SARS-CoV-2 vaccination were suboptimal, but more pronounced than in adult kidney recipients. Use of Tac and MMF was associated with impaired immune response to vaccination. SARS-CoV-2-specific humoral response corresponded only partially to cell-mediated response. Additional monitoring of SARS-CoV2-Tvis might be recommendable to imp rove assessment of the individual vaccine response and thereby to personalize the decision on the necessity of further vaccine doses.

Der zunehmende Mangel an Spenderorganen hat aufgrund der verlängerten Wartezeit einen negativen Einfluss auf das Patientenüberleben sowie Entwicklung und Lebensqualität von terminal niereninsuffizienten Kindern und Jugendlichen, die dringend www.forschungspreis-kinderheilkunde.de Seite 5 von 4 eine Spenderniere benötigen. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, die Funktionsdauer von transplantierten Organen zu verlängern. Ergänzend zum klassischen Blutspiegelmonitoring sollen die neuen Immunmonitoring-Verfahren dazu dienen, den individuellen Grad der Immunsuppression nach NTx besser einzuschätzen, um Über- und Unterimmunsuppression frühzeitig zu erkennen. Ziel dieses innovativen Immunmonitorings ist es, Infektionen und Abstoßungen nach NTx zu verhindert und das Transplantatüberleben zu verlängern. Langfristig könnte dadurch Lebensqualität, Entwicklung und Lebenserwartung der transplantierten Kinder verbessert werden. Das in diesem Projekt geplante Immunmonitoring basiert auf der Analyse innovativer Biomarker wie TTV und Tvis in Kombination mit einer Immunzellcharakterisierung. Mittels eines Panels von Biomarkern und klinischen Parametern soll erstmalig ein Prädiktionsmodell für den Grad der Immunsuppression mittels KI berechnet und etabliert werden, der eine maßgeschneiderte Immunsuppression nach pädiatrischer NTx ermöglicht. 

Kooperationspartner: Prof. Dr. med. Burkhard Toenshoff, Heidelberg, Dr. med. Johannes Holle, Berlin

Immunosuppressive therapy is given to avoid acute and chronic rejections after pediatric kidney transplantation. However, this causes an increased risk of severe viral complications and bacterial infections and is associated with serious side effects. It is therefore crucial to achieve the optimal individual balance between over- and underimmunosuppression and thereby avoid unnecessary exposure to immunosuppressive drugs. Steering of immunosuppression is actually achieved primarily by monitoring of trough levels that mirror pharmacokinetics (although not, however, pharmacodynamics). Nonetheless, diagnostic and prognostic markers to assess the individual intensity of immunosuppression are missing. Other potential methods to determine immune function and grade of immunosuppression, such as analysis of the Torque Teno virus load or virus-specific T cells (Tvis), are currently being evaluated. Tvis control virus replication and have been shown to correlate with virus-specific as well as general cellular immune defense, which represents the individual’s susceptibility to infections. Accordingly, additional monitoring of Tvis represents a new opportunity for personalizing the management of antiviral therapy, identifying overimmunosuppression and avoiding unnecessary therapeutic interventions, all of which could also lead to potential economic benefits.